Chromatography ni mojawapo ya mbinu za kutenganisha dutu. Inatumika kwa uchambuzi unaofuata wa ubora na kiasi wa mali ya kimwili na kemikali ya microparticles. Tofauti ya teknolojia hii ni chromatography ya mshikamano. Wazo la kutofautisha misombo ya protini kwa kutumia mali ya mshikamano wa Masi imejulikana katika sayansi kwa miongo kadhaa. Hata hivyo, imepokea maendeleo yake tu katika miaka ya hivi karibuni, baada ya kuanzishwa kwa nyenzo zenye porous hydrophilic kutumika kama tumbo. Njia hii inaruhusu kutatua matatizo yote mawili ya uchanganuzi (mgawanyo wa dutu na utambulisho wao) na matatizo ya maandalizi (utakaso, mkusanyiko).
Essence
Kromatografia ya mshikamano (kutoka neno la Kilatini affinis - "inayopakana", "inayohusiana") inatokana na mwingiliano wa mshikamano, ambao ni uundaji wa vifungo mahususi kati ya molekuli ya spacer (ligand au affinant) na molekuli lengwa. Taratibu hizi zimeenea katika asili (uhusiano wa wapatanishi au homoni na vipokezi, antibodies naantijeni, mseto wa polynucleotides na aina nyingine za michakato). Katika dawa, kromatografia ya mshikamano imekuwa ikitumika kwa madhumuni ya vitendo tangu 1951
Vijenzi vimetenganishwa kama ifuatavyo:
- mmumunyo wa kufanya kazi ulio na dutu ya kutengwa hupitishwa kupitia sorbent;
- kamba iliyowekwa kwenye tumbo la sorbent huhifadhi dutu hii;
- imekolezwa (mlundikano);
- uchimbaji wa dutu iliyotengwa na sorbent kwa kuosha na kutengenezea.
Njia hii hukuruhusu kutenga visanduku vyote. Tofauti kutoka kwa kromatografia ya uchanganyaji wa kitamaduni ni kwamba kuna uunganisho thabiti wa kibiolojia wa kijenzi kilichojitenga kwa sorbent, ambayo ina sifa ya uteuzi wa juu.
Adsorbents
Vitu vifuatavyo vinatumika kama adsorbents:
- Michanganyiko ya gel kulingana na agarose, polisakaridi inayopatikana kutoka kwa agari. Aina zinazotumiwa zaidi ni aina 3: sepharose 4B, CL (agarose iliyounganishwa na msalaba) na affi-gel. Utungaji wa mwisho ni gel iliyobadilishwa ya agarose na polyacrylamide. Ina ajizi kubwa ya kibayolojia, kemikali nyingi na ukinzani wa mafuta.
- Silika (silica gel).
- Kioo.
- polima hai.
Ili kuondoa vizuizi vya kiufundi wakati wa mguso wa kano, vitu vya ziada hutumiwa kuitenganisha na mtoa huduma (peptidi, diamines, polyamines, oligosaccharides).
Vifaa
Kifaa cha kromatografia kinachohusiana kinajumuisha vitengo vikuu vifuatavyo:
- tanki za kuhifadhi kwa awamu ya simu (eluent);
- pampu za shinikizo la juu kwa usambazaji wa kati (mara nyingi hujirudia);
- chujio cha kusafisha mabaki kutoka kwa vumbi;
- kifaa cha kuwekea dawa;
- safu wima ya kromatografia ya kutenganisha mchanganyiko;
- kigunduzi cha kugundua vipengee vilivyotenganishwa vikiacha safu;
- vinasa sauti vya kromatogramu na kitengo cha processor (kompyuta).
Ili kupunguza kiwango cha hewa iliyoyeyushwa, heliamu hupitishwa kwanza kupitia awamu ya simu. Ili kubadilisha mkusanyiko wa eluent, pampu kadhaa zinazodhibitiwa na programu zimewekwa. Nguzo za Chromatographic zinafanywa kwa chuma cha pua (kwa mahitaji ya kuongezeka kwa upinzani wa kutu), kioo (chaguo zima) au akriliki. Kwa madhumuni ya maandalizi, kipenyo chao kinaweza kutofautiana kutoka cm 2 hadi 70. Katika kromatografia ya uchanganuzi, safu wima ndogo Ø10-150 µm hutumiwa.
Ili kuongeza usikivu wa vigunduzi, vitendanishi huletwa kwenye mchanganyiko, ambavyo huchangia katika uundaji wa vitu vinavyofyonza miale zaidi katika eneo la ultraviolet au eneo linaloonekana la wigo.
Mbinu
Kuna aina 2 kuu za kromatografia ya uhusiano wa kioevu:
- Safu wima, ambayo safu wima hujazwa na awamu isiyosimama na mchanganyiko hupitishwa ndani yake kwa mtiririko.mwenye ujuzi. Kutengana kunaweza kutokea kwa shinikizo au chini ya mvuto.
- Safu nyembamba. Ufafanuzi husogea kando ya safu ya adsorbent ya gorofa chini ya ushawishi wa nguvu za capillary. Kitangazo huwekwa kwenye sahani ya glasi, fimbo ya kauri au quartz, karatasi ya chuma.
Hatua kuu za kazi ni pamoja na:
- maandalizi ya adsorbent, fixation ya ligand kwenye carrier;
- kulisha mchanganyiko wa kutenganisha kwa safu wima ya kromatografia;
- upakiaji wa awamu ya rununu, kipengele kinachofunga kwa ligand;
- uingizwaji wa awamu ili kutenga dutu inayofungamana.
Lengwa
Kromatografia ya mshikamano hutumika kutenga aina zifuatazo za dutu (aina ya kano inayotumika imeonyeshwa kwenye mabano):
- analojia za vizuizi vya enzymatic, substrates na cofactors (enzymes);
- vitu vya kibayolojia vyenye dalili za kutengwa kwa kijeni, virusi na seli (kingamwili);
- wanga uzani wa juu wa molekuli, polima za monosaccharide, glycoproteini (lectini);
- protini za nyuklia, nucleotidyltransferasi (nucleic acids);
- vipokezi, protini za usafirishaji (vitamini, homoni);
- protini zinazoingiliana na utando wa seli (seli).
Teknolojia hii pia hutumika kupata vimeng'enya visivyohamishika, na kuvifunga kwa selulosi huruhusu utengenezwaji wa immunosorbents.
Chromatography ya protini zinazofunga DNA
Kutenga kwa protini zinazofunga DNA hufanywa kwa kutumiaheparini. Glyosaminoglycan hii ina uwezo wa kufunga molekuli mbalimbali. Kromatografia ya mshikamano ya protini za kundi hili hutumika kutenganisha vitu kama vile:
- sababu za kuanzisha na kurefusha tafsiri (muundo wa molekuli na protini za asidi ya nukleiki);
- vizuizi (vimeng'enya vinavyotambua mfuatano fulani katika DNA ya mistari miwili);
- ligasi za DNA na polima (enzymes zinazochochea muunganisho wa molekuli mbili kuunda dhamana mpya ya kemikali na kuhusika katika uigaji DNA);
- serine protease inhibitors ambazo huchukua jukumu muhimu katika michakato ya kinga na uchochezi;
- sababu za ukuaji: fibroblast, Schwann, endothelial;
- protini za tumbo la nje ya seli;
- vipokezi vya homoni;
- lipoproteini.
Hadhi
Njia hii ni mojawapo ya mbinu mahususi zaidi za kutenganisha viambata tendaji (vimeng'enya na mkusanyiko mkubwa - virusi). Hata hivyo, haitumiki tu kutenganisha dutu amilifu kibiolojia.
Ugunduzi wa kingamwili kwa idadi ndogo, tathmini ya kiasi cha asidi ya polyadenylic, uamuzi wa haraka wa molekuli za dehydrogenases, uondoaji wa uchafuzi fulani, utafiti wa kinetics ya uanzishaji wa aina isiyofanya kazi ya trypsin, muundo wa molekuli ya binadamu. interferon - hii sio orodha nzima ya masomo ambayo ushirika hutumiwa. chromatography. Matumizi katika kliniki yanatokana na faida zake kama vile:
- Uwezo mzuri wa kusafishaprotini, polysaccharides, asidi nucleic. Zinatofautiana kidogo katika tabia zao za kimwili na kemikali na hupoteza shughuli wakati wa hidrolisisi, denaturation na aina nyingine za matibabu zinazotumiwa katika mbinu nyingine.
- Kasi ya utengano wa dutu, asili inayobadilika ya mchakato.
- Hakuna haja ya utakaso maalum wa kimeng'enya na uunganishaji wa isoenzyme ili kubaini viambatanisho vya kutenganisha.
- Ina uwezo wa kutenganisha aina mbalimbali za dutu.
- Matumizi ya chini ya kano.
- Uwezekano wa mgawanyo wa dutu kwa kiasi kikubwa.
- Mchakato unaoweza kutenduliwa wa kuunganisha macromolecules ya kibiolojia.
Mbinu hii inaweza kuunganishwa na nyingine, ili kuweka uga wa ziada (mvuto, sumakuumeme). Hii hukuruhusu kupanua uwezo wa kiufundi wa kromatografia.
Uhandisi wa Enzymatic
Shukrani kwa mbinu hii, uendelezaji hai wa tawi jipya la teknolojia ya kibayoteknolojia - uhandisi wa vimeng'enya ulianza.
Kromatografia ya mshikamano ya kutenga kimeng'enya ina faida zifuatazo:
- kupata vimeng'enya kwa wingi kutokana na muda mfupi, matokeo yake - kupungua kwao kwa bei;
- uzuiaji wa vimeng'enya unaweza kupanua kwa kiasi kikubwa wigo wa matumizi yake katika dawa na viwanda;
- Uhusiano wa vimeng'enya na usaidizi thabiti usioyeyushwa huwezesha kuchunguza ushawishi wa mazingira madogo na mwelekeo wa athari, ambazo huchukua jukumu muhimu katika michakato ya asili na ya kisaikolojia.
