Saitometi ya mtiririko ni mbinu ya utafiti wa saitolojia inayotumika kwa uchanganuzi wa kina wa seli. Faida yake ni kwamba hukuruhusu kusoma kila seli kibinafsi. Aina hii ya uchanganuzi husaidia kutathmini vigezo kadhaa katika mamia ya seli katika suala la sekunde. Kwa sababu hiyo, cytofluorimetry inachukuliwa kuwa mojawapo ya mbinu za haraka na sahihi zaidi za uchanganuzi zinazopatikana kwa sasa kwa wanasayansi na matabibu.
Kanuni
Kanuni ya saitoometri ya mtiririko inategemea kipimo cha mtawanyiko wa mwanga na mwangaza (fluorescence) wa seli. Kusimamishwa kwa seli hupitishwa kama mkondo kwa kasi ya juu kupitia seli ya cytometer, ambapo huwashwa na leza. Kinachojulikana kama kuzingatia hydrodynamic pia hufanywa huko. Utaratibu wake ni kwamba mtiririko kutoka kwa seli na chembe zilizosomwa kwenye duka hutiririka ndani ya ndege ya nje, ambayo ina kasi ya juu. Kwa hivyo, chembe chembe hupangwa katika mlolongo uliopangwa.
Seli za awali zimewekwa alama za rangi maalum za fluorescent (fluorochrome). Shukrani kwao, boriti ya laserhusisimua mwanga wa pili. Ishara za mwanga zilizopokea zimesajiliwa na wachunguzi. Baadaye, maelezo huchakatwa kwa kutumia kanuni za programu zinazokuruhusu kuhesabu idadi ya seli ambazo hutofautiana katika baadhi ya vigezo.
Utafiti kwa kutumia hadubini ya kawaida mara nyingi hushindwa kutofautisha kati ya seli tofauti kwa sababu zinafanana. Cytofluorimetry inaweza kutoa data nyingine (uadilifu wa muundo wa DNA), kuchanganua usemi wa protini, uhai wa seli.
Kwa kuwa msisimko wa fluorochromes unahitaji miale ya mwanga yenye urefu tofauti wa mawimbi, pamoja na aina tofauti za vigunduzi, usakinishaji wa kisasa una chaneli kadhaa za utambuzi (kutoka 4 hadi 30). Idadi ya emitter ya leza inaweza kuwa kutoka 1 hadi 7. Vifaa changamano zaidi huruhusu tafiti za vigezo vingi vya sifa kadhaa za chembe kwa wakati mmoja.
Faida na hasara
Faida za saitoometri ya mtiririko ni pamoja na:
- kasi ya juu ya uchakataji (usajili wa hadi matukio elfu 30 ndani ya sekunde 1);
- uwezekano wa kusoma idadi kubwa ya visanduku (hadi milioni 100 katika sampuli);
- Kuhesabu ukubwa wa mwanga wa fluorescent;
- uchambuzi wa kila seli;
- utafiti wa samtidiga wa michakato mingi tofauti;
- mgawanyo otomatiki wa data kwa idadi ya seli;
- taswira ya ubora wa matokeo.
Sifa nyingine ya teknolojia hii ni hiyochembe iliyochambuliwa inaweza kuharibiwa na ufumbuzi kadhaa wa fluorescent. Shukrani kwa hili, utafiti wa vigezo vingi hutokea.
Hasara ni pamoja na ugumu wa vifaa vya kiufundi na hitaji la maandalizi maalum ya sampuli.
Cytometers
Vifaa vya kwanza vya aina hii vilionekana tayari mnamo 1968 nchini Ujerumani, lakini vilienea baadaye sana. Hivi sasa, vifaa vyote vinavyofanya kazi kwa njia ya saitoometri ya mtiririko vinaweza kugawanywa katika aina 2:
- vifaa vinavyopima mionzi ya umeme (wimbi mbili au zaidi), 10° na 90° mtawanyiko wa mwanga (pembe ya chini na kitambua kisambaza taarifa cha pembeni);
- vifaa ambavyo, pamoja na kupima vigezo kadhaa vya simu za mkononi, hupanga kiotomatiki katika vikundi kulingana na vigezo hivi.
Kitambuzi cha kutawanya mbele kimeundwa ili kubainisha ukubwa wa seli, na kifaa cha kutawanya cha pembeni hukuruhusu kupata taarifa kuhusu kuwepo kwa chembechembe za ndani ya seli, uwiano wa ujazo wa saitoplazimu na kiini.
Sitomita za kawaida, tofauti na darubini nyepesi, haziruhusu kupata picha ya kisanduku. Walakini, katika miaka ya hivi karibuni, vifaa vya pamoja vimetengenezwa ambavyo vinaweza kuchanganya uwezo wa darubini na cytofluorimeter. Yatajadiliwa hapa chini.
Sitomita za Kupiga picha
Kwa ala zinazotumika katika saitoometri ya classical mtiririko,kipengele kimoja ni tabia: ikiwa matukio ya nadra yanasajiliwa katika idadi ya seli zilizochambuliwa, basi hakuna njia ya kutathmini nini kiini chao ni. Chembe hizi zinaweza kuwa mabaki ya seli zilizokufa au kundi adimu lao. Katika vifaa vya kawaida, data kama hiyo haijumuishwi katika mtiririko wa jumla wa matukio, lakini ndiyo inayoweza kuwa ya thamani mahususi kwa uchanganuzi wa kisayansi na kimatibabu.
Kizazi kipya cha sitomita za mtiririko wa picha hukuruhusu kupiga picha ya kila seli inayopita katika mtiririko kupitia eneo la kigunduzi. Ni rahisi kuiona kwa kubofya eneo linalolingana la mchoro, ambalo linaonyeshwa kwenye kichunguzi cha kompyuta.
Maeneo ya maombi
Flow cytometry ni mbinu ya ulimwengu wote inayotumika katika nyanja nyingi za dawa na sayansi:
- immunology;
- oncology;
- upandikizaji (upandikizaji wa uboho nyekundu, seli shina);
- hematology;
- toxicology;
- biokemia (kipimo cha asidi ndani ya seli, uchunguzi wa vigezo vingine);
- pharmacology (kutengeneza dawa mpya);
- microbiology;
- parasitology na virology;
- oceanology (utafiti wa phytoplankton kutathmini hali ya vyanzo vya maji na kazi zingine);
- nanoteknolojia na uchanganuzi wa chembechembe ndogo.
Kinga
Mfumo wa kinga ya binadamu una aina mbalimbali za seli. Flow cytometry katika immunology inafanya uwezekano wa kutathmini muundo na kazi zao, yaani, kufanya morphofunctional.uchambuzi.
Utafiti kama huo husaidia kuelewa asili changamano ya kinga. Phenotypes za seli hubadilika kama matokeo ya kuanzishwa na antijeni, maendeleo ya patholojia, na mambo mengine. Cytofluorometry inaweza kutenganisha idadi ndogo ya seli za kinga katika mchanganyiko changamano na kutathmini mabadiliko yao yote kwa wakati.
Oncology
Jukumu moja muhimu zaidi katika oncology ni kutofautisha seli kulingana na aina zao. Kanuni ya uchambuzi kwa cytometry ya mtiririko katika oncohematology inategemea jambo lifuatalo: wakati sampuli inatibiwa na rangi maalum ya fluorescent, inafunga kwa protini za cytoplasmic. Baada ya mgawanyiko katika seli zinazoenea kikamilifu, maudhui yake hupungua kwa nusu. Ipasavyo, nguvu ya mwangaza wa seli hupungua mara mbili.
Kuna njia zingine za kugundua seli zinazoongezeka:
- matumizi ya rangi zinazofunga DNA (propidium iodide);
- matumizi ya uracil yenye lebo;
- usajili wa ongezeko la kiwango cha kujieleza kwa protini za cyclin, ambazo huhusika katika udhibiti wa mzunguko wa seli.
